逆向示蹤技術（retrograde tracing）也稱為逆行標記技術，是神經科學中的一種常用研究方法，1967年Fink等將神經纖維變性研究與銀浸漬染色技術兩者結合應用后開創了逆行示蹤技術的First嘗試，并取得了開創性的結果，此后該技術經過學者們的不斷改進與創新，已日漸成為神經科學中不可替代的重要研究方法。逆行示蹤技術通過在神經元的周圍軸突或運動終板處注射逆行示蹤劑，利用神經元的主動轉運或被動轉運機制將注射部位的示蹤劑轉運至神經元胞質內，具體的途徑包括：受體介導或濃度依賴的跨膜轉運以及胞吞作用等，被神經元攝取的逆行示蹤劑依靠軸漿運輸的動力機制從注射部位的軸突遠端逐漸運輸至相連的神經元胞體及樹突，一段時間后整個神經細胞內將充滿示蹤劑，此時可根據逆行示蹤劑的種類選擇不同的檢測方法，從而觀察被標記的神經元數目及形態等。該技術可用于神經系統中某些特定核團傳入神經的起源追蹤研究，從而進一步幫助人們推斷這些核團的具體功能，為解開中樞神經系統及外周神經系統復雜的投射網絡提供了一種可行的研究方法。

逆行示蹤技術（retrograde tracing）是神經科學研究中的一種常用的示蹤方法，其能夠從定性及定量的角度探究神經系統之間的復雜問題，為那些關于中樞神經系統功能、細胞間相互聯系、神經細胞分布及數目等方面的研究提供了一種簡單有效的實驗方法。隨著逆行示蹤技術的不斷發展，其在神經科學研究中的作用也更加被學者們所認可，尤其是近30年來，由于示蹤劑種類和應用方法日益革新，逆行示蹤技術的發展可謂日新月異。目前研究中應用較多的逆行示蹤劑有：霍亂毒素B亞單位、熒光金、辣根過氧化物酶、固藍、異硫氰酸鹽羅丹明、羰花青染料、熒光乳膠微球、生物胞素和神經生物胞素等；常用的應用方法有：壓力注射法、電離子滲透導入法和染料晶體植入法。

常用逆行示蹤劑：

霍亂毒素B亞單位（Cholera toxin subunit B ，CTB）CTB是目前應用非常廣泛的一類逆行示蹤劑，其來源于霍亂弧菌產生的霍亂毒素，作為霍亂毒素中的非毒性亞單位，CTB可以通過與神經節苷脂GM1的戊多糖鏈結合從而使毒素粘附于細胞表面，基于這一原理，使得CTB可以選擇性地被那些富含神經節苷脂GM1的神經細胞所攝取，從而特異性地標記神經細胞，正是由于CTB在細胞中的攝取有賴于CTB與神經元突觸膜上GM1神經節苷脂特異性的結合，此種跨膜轉運的方式不會影響細胞的形態學變化，因此更適合于細胞形態學的研究。通常情況下，CTB在使用前常需配置成1%的CTB磷酸鹽緩沖液。起初CTB是作為非熒光示蹤劑而被應用于逆行示蹤技術中，直到熒光結合形式的CTB出現后，其才逐漸轉變為一種常用的熒光示蹤劑，尤其是近幾年Alexa Fluor (AF)與CTB的成功結合可以說是熒光示蹤劑中的一重要突破，因為AF系列的熒光比以往的熒光更強、更穩定。目前AF熒光結合形式的CTB在探究視網膜功能和中樞神經系統復雜的關系方面應用的日漸廣泛，同時不同種類AF熒光的應用也促使了多重逆行標記的發展。此外研究發現CTB具有良好的相容性，其可與其他示蹤劑如葡聚糖胺等同時混合注射來進行逆行標記。

熒光金（Fluoro-Gold，FG）1986年Schmued等First發現了FG這一新型染料，其通常以1-10%的濃度溶解在緩沖液中，逆行示蹤時可以采用離子電滲導入法或者壓力注射法將FG溶液注射到目標靶區。注射部位的FG可以通過受損的軸突和軸突末端，不斷地在細胞膜形成的囊泡內積累，然后以逆行運輸的方向向細胞胞體方向轉運，一段時間后，可以在被標記的神經元胞體內觀察到顆粒狀的FG染料[3]。羥芪巴脒是FG中主要的有效成分，它的光學特性隨酸堿值的大小而變化。在生理條件下，用325nm波長的合適激發光激發FG后可以產生最大波長為440nm的金黃色熒光，具有良好的靈敏度及穩定性。隨著技術的發展，FG-抗體的出現意味著FG還可以轉變為一種更穩定而不淬滅的形式被應用于逆行示蹤技術中，這無疑擴大了FG的適用范圍。值得注意的是，盡管FG在逆行標記中有很多明顯的優勢，但它并不適合于那些需要長時間等待后觀察標記效果的逆行示蹤研究。

辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP) HRP作為逆行示蹤劑的應用無疑是一次突破性的進展，Kristensson和Olsson等于1971年第一次將酶蛋白（即HRP）注入到大鼠的腓腸肌內，并于一段時間后通過二氨基聯苯胺（DAB）基質染色法檢測脊髓運動神經元內的HRP的活性，從此開創了酶蛋白在逆行示蹤技術中的探索應用。同年，該方法也被成功地用于標記大鼠舌下神經核內的運動神經元。研究發現HRP的內吞攝取過程不僅可以發生在神經元的所有突起部位，其同樣可以發生在神經元的胞體部位，此外，在注射部位采取壓力注射方法更容易使HRP被周圍的神經元突起攝取，被神經元攝取進入細胞內的HRP會以核內體的形式被運輸至神經細胞的核周體部位而被溶酶體代謝性降解，鏡下典型的核內體往往呈現出橢圓形或管狀的外觀。目前，HRP在逆行示蹤技術中的應用形式有很多種，如泡沫、凝膠和微球等，但采用顱內注射0.1-0.5μl濃度為20-50%的HRP鹽溶液仍然是中樞神經系統研究中常用的應用方法，因為無論是泡沫、凝膠和微球中的任一種HRP應用形式都很難進行注射，只能采用局部植入的方式進行逆行示蹤。HRP的檢測需依賴于自身的酶活性，其可與*、DAB或者四甲基聯苯胺（TMB）反應后生成穩定及高電子密度的棕色沉淀，正是這個原因，被HRP逆行標記的神經元可以在電鏡下進行超微結構的分析，然而，HRP在逆行示蹤技術中同樣存在很多明顯的缺陷，如無法完整顯示被標記的細胞以及無法在活體下直接進行檢測等。

固藍（Fast Blue，FB）3%FB水溶液是常用的逆行示蹤劑，其可被神經元的軸突末端攝取，并均勻分布在細胞胞體內，但其對樹突的充盈并不理想。當用360nm波長的紫外光激發時FB可發出藍色的熒光，但長時間照射可產生較高的光毒性，這也是大多數藍色熒光示蹤劑如True Blue（TB）和Granular Blue(GB)等的常見問題，相比于它們而言，FB在逆行標記中的效果更好。延長逆行標記動物的存活時間可以增加FB在神經元內的熒光強度，但這也容易導致熒光的滲漏，造成神經元周圍膠質細胞的著色和被標記神經元細胞個數的減少。研究發現在細胞培養條件下，FB可影響細胞的粘附與增殖，這將限制其在細胞培養方面的應用。

異硫氰酸鹽羅丹明（Rhodamine-isothiocyanate，RITC ）RITC作為逆行熒光示蹤劑可被波長為545nm的綠光激發出波長大于590 nm的紅色熒光，注射時其通常以1-3%的濃度溶解于含有0.2%乙醇或1%二甲基亞砜（DMSO）的水溶液內。研究表明RITC較FB而言，其在被標記的細胞內可以更長時間的存留而不發生熒光滲漏，效能上明顯優于FB。在細胞培養條件下也未發現明顯的光毒性。在逆行示蹤研究中RITC的熒光強度比羰花青染料的更強，細胞內的分布更加均勻。綠色熒光的FITC可以與紅色熒光的RITC二者聯合應用從而實現雙重標記，但是FITC的熒光淬滅速度比RITC更快，所以并不適合活體情況下的雙重逆行標記。

羰花青染料（Carbocyanine dyes）羰花青染料具有高度的親脂性，即便是對于被固定的組織，其仍然可以透過它們的細胞膜而進行標記，但是親脂的特性也限制了其在活體研究中的應用。羰花青染料通常被溶解在有機溶劑中，常用的有機溶劑有乙醇/DMSO的等比混合液以及二甲基甲酰胺,注射濃度為2.5-3%。當羰花青染料以囊泡的形式被神經元攝取后，其將在細胞內各個方向進行主動擴散，但細胞間并不會發生染料的擴散。在穩定性方面，其可以在很長一段時間內保存良好的活性，研究發現其甚至可以在活體條件下保存穩定達1年以上。在多樣性方面，羰花青染料有多種顏色的熒光可供選擇，如紅色熒光的Dil和綠色熒光的DiO等，它們的在逆行示蹤研究上的有效性已經在很多研究上得以證實。

熒光乳膠微球（fluorescent latex beads）熒光乳膠微球內可包含紅色和綠色兩種熒光物質，其中由羅丹明紅色熒光填充的微球在信號強度上優于綠色熒光填充的微球。其在逆行示蹤注射之前需要提前配制成水溶液，局部應用時可用針頭直徑30-50μm的Hamilton注射器直接注射，應用的劑量根據靶區域的大小從30nl-0.5μl之間不等[38]。目前關于熒光乳膠微球的具體攝取機制還不是很清楚，局部注射后存活24-48時即可觀察到被其逆行標記的大多數神經元，此外，這些被標記的神經元表現出良好的組織穩定性，即便是數月后也未曾觀察到示蹤劑的滲漏現象，正是這些優點使得熒光乳膠微球成為了神經解剖學中逆行標記神經元的一種可靠選擇。但值得注意的是，由于乳膠微球通常只能顯示出被逆行標記的胞體，相比于很多熒光染料而言并不具備優勢，同時，其在丙三醇溶劑中熒光容易淬滅的特性以及暴露在二甲苯和酒精內容易遭受破壞的特點也限制了其更廣泛的應用。

生物胞素和神經生物胞素（biocytin and neurobiotin）生物胞素和神經生物胞素最初是作為一種細胞內標志物而被用于電泳試驗中，此后人們發現其還可以用于神經解剖學中的示蹤研究。研究證實，生物胞素和神經生物胞素不僅可用于逆行示蹤技術中，其同樣可以應用于順行示蹤技術中，采用強電流和大孔徑移液器的細胞外電離子滲透導入法是其常用的注射方式。由于生物胞素和神經生物胞素在細胞內具有良好的轉運特性，因此可以清楚地顯示被標記神經元的軸突和樹突結構。與其他種類的示蹤劑相比較，生物胞素和神經生物胞素的分子量相對較小（分別為372kDa和286kDa），同時具有高親和力的抗生物胞素蛋白能與之特異性的結合，因此當用這些結合有HRP的抗生物胞素蛋白與標記細胞內的生物胞素和神經生物胞素特異性結合時，便可間接地依賴HRP對標記的細胞進行顯影，這便是該示蹤劑能被檢測的原因。除了HRP可被結合于抗生物胞素蛋白外，研究還發現熒光染料同樣也可被結合到抗生物胞素蛋白上，因此學者在研究中可以根據自己的需求選擇不同的抗生物胞素蛋白，但值得注意的是，無論是那種方法，因為都需要借助免疫組織化學或免疫組織熒光進行顯色，缺點就是過程繁瑣及無法在活體上直接進行觀察。

葡聚糖胺（Dextran amines）事實上，葡聚糖胺更多的情況下是被作為一種順行示蹤劑而應用于研究中，但其同樣可以被用作逆行示蹤劑而應用于研究中。在理化性質方面，葡聚糖胺具有很好的水溶性，其分子質量較FG、羰花青染料和RITC等大（10kDa）。研究發現，葡聚糖胺在注射部位更容易被損傷的神經元攝取并逆行轉運至胞體內，因此當在局部注射葡聚糖胺進行逆行標記時，如果聯合注射5%的Triton X-100將會在一定程度上提高神經元對葡聚糖胺的攝取效率。葡聚糖胺是神經解剖學中非常重要的一類示蹤劑，其可以非常精細地顯示被標記細胞的突起結構并能被多種檢測方法檢測，例如：葡聚糖胺可以與熒光染料或生物胞素形成復合物，從而能夠根據復合物的特性而被相應的檢測方法檢測出來。然而，葡聚糖胺標記的細胞在保存時間上較FG等示蹤劑短，因此其可能更適合于那些持續時間較短的實驗研究。

3. 常用應用方法逆行示蹤技術中除了需要選擇合適的逆行示蹤劑，如何將選擇的示蹤劑導入到目標部位也是需要考慮的重要環節，目前研究中應用的局部導入方法有三種：即壓力注射法、電離子滲透導入法和染料晶體植入法。

壓力注射法（Pressure injection）壓力注射法是一種直接的示蹤劑導入方法，在注射之前只需要對示蹤劑進行溶解，然后借助微量注射器（如Hamilton注射器）和標準的電控推拉器即可完成注射。根據電控推拉器的原理不同，壓力注射時的動力可來源于氣體壓力或者液壓裝置系統，其中后者較前者在控制注射劑量的精確性方面更為準確，因此更加受到學者們青睞。

壓力注射法在選擇示蹤劑的溶劑時需要考慮到示蹤劑自身的溶解特性，如FB、FG和葡聚糖胺等水溶性的示蹤劑需選擇水性溶劑，而其他如羰花青染料等則需要選取有機溶劑進行溶解，此外，對于那些不溶性的染料在注射前需要對其配置而成的懸濁液進行超聲粉碎，并用過濾器進行過濾后才可以直接應用壓力注射法局部注射導入到目標靶區。至于每種逆行示蹤劑的注射濃度，則需要充分考慮其自身的標記敏感性和局部的毒性反應等。

電離子滲透導入法（Iontophoretic injection）電離子滲透導入法是利用示蹤劑分子所帶電荷量的大小，通過給予外加電流使示蹤劑分子被電場作用力導入至注射部位的一種示蹤劑導入方法。通常情況下，人們會將電流直接外加到吸有1-10%濃度示蹤劑溶液的微量移液器上，根據電極頭直徑的不同，電離子滲透導入法除了可以應用于示蹤劑的細胞內注射外，還可以應用于示蹤劑的細胞外注射。以具體的操作為例，在進行電離子滲透導入法細胞內注射時，逆行示蹤劑通常被溶解在2MKCl溶液或2M乙酸鉀溶液內，注射時外加電流的強度為2-5nA，并至少維持10-60分鐘。研究發現，電流維持時間作為電離子滲透導入法中最主要的調控參數，其可隨著應用低摩爾濃度的電極溶液而被極大程度的縮減，例如將生物胞素以電離子滲透導入法的方式導入至神經元胞體內，在應用0.5M的乙酸鉀溶液時只需用3nA的電流維持3分鐘即可完成[61]。對于電離子滲透導入法的細胞外注射，其電極頭的直徑會相對更大，外加的電流也會增加至10μA，此外，電離子滲透導入法還具備一個獨到的優勢，其可以依靠傳統的電生理技術對目標靶區進行精確的定位，從而使示蹤劑的導入更為準確。

染料晶體植入法（Insertion of dye crystals）當逆行示蹤的目標靶區位置表淺且容易暴露時，可以選擇染料晶體植入法進行示蹤劑的局部導入。其優點是可以在顯微鏡直視下進行操作，因此可以良好地控制染料晶體植入的部位和深度，此外，其在逆行示蹤劑導入的有效性方面也較其他種類的方法更高。在局部應用羰花青染料（如Dil和DiAsp）作為逆行示蹤劑時，染料晶體植入法是一種可供選擇的有效方法，此外，對于那些以結晶形式存在的示蹤劑在進行小劑量的逆行示蹤時，同樣可以選擇該方法作為示蹤劑的局部導入方法，如小麥胚芽凝集素共軛結合的辣根過氧化物酶（wheatgerm agglutinin conjugated to HRP，WGA-HRP）。有研究發現，對于親脂性羰花青染料，如果在植入染料晶體之前對其表面滴加1滴弗氏不佐劑可以很好地提高示蹤劑在組織內的擴散能力。此外，還有學者指出染料晶體植入法不僅僅適用于那些位置表淺且容易暴露的組織標記，其同樣可以將植入深度增加至400μm以上，從而實現對深部腦組織的逆行標記。

目前應用的示蹤劑大致可被分為熒光示蹤劑和非熒光示蹤劑兩大類，其中熒光示蹤劑因為自身具備發放熒光的特性，標記后可直接觀察，操作簡單易行，可應用于活體組織或細胞培養方面的研究，此外，其因為自身多熒光種類的多樣性，可實現多種熒光示蹤劑在同一個體內的同時標記，即多重示蹤。

本文章引用來源： 姚飛 眼科學 新疆醫科大學 2016（學位年度）

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